プレガバリンはGABAAまたはGABAB受容体アゴニストではありません。
プレガバリンはガバペンチノイドであり、特定のカルシウムチャネルを阻害することによって作用します。具体的には、特定の電位依存性カルシウムチャネル（VDCC）の補助α2δサブユニット部位のリガンドであり、それによってα2δサブユニットを含むVDCCの阻害剤として作用します。2つの薬物結合α2δサブユニット、α2δ-1とα2δ-2があり、プレガバリンはこれら2つの部位に対して同様の親和性を示します（したがって、それらの間の選択性の欠如）。プレガバリンは、α2δVDCCサブユニットへの結合において選択的です。プレガバリンはGABAアナログであるという事実にもかかわらず、GABA受容体に結合せず、in vivoでGABAまたは別のGABA受容体アゴニストに変換されず、GABAの輸送または代謝を直接調節しません。ただし、プレガバリンは、GABAの合成に関与する酵素であるL-グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）の脳内発現を用量依存的に増加させることがわかっているため、脳内のGABAレベルを増加させることによって間接的なGABA作動性効果をもたらす可能性があります。現在、プレガバリンの効果がα2δ含有VDCCの阻害以外のメカニズムによって媒介されているという証拠はありません。それに応じて、プレガバリンによるα2δ-1含有VDCCの阻害は、その抗けいれん作用、鎮痛作用、および抗不安作用の原因であるように思われます。
化学構造においてプレガバリンおよび他のガバペンチノイドに非常に類似している内因性α-アミノ酸L-ロイシンおよびL-イソロイシンは、ガバペンチノイドと同様の親和性を有するα2δVDCCサブユニットの明らかなリガンドです（例えば、L-のIC50 = 71 nMイソロイシン）、およびマイクロモル濃度でヒト脳脊髄液に存在します（例えば、L-ロイシンの場合は12.9μM、L-イソロイシンの場合は4.8μM）。それらはサブユニットの内因性リガンドである可能性があり、ガバペンチノイドの効果に競合的に拮抗する可能性があると理論付けられています。それに応じて、プレガバリンやガバペンチンのようなガバペンチノイドはα2δサブユニットに対してナノモルの親和性を持っていますが、インビボでのそれらの効力は低いマイクロモル範囲にあり、内因性L-アミノ酸による結合の競合がこの不一致の原因である可能性が高いと言われています。

ある研究では、プレガバリンは、α2δサブユニットを含むVDCCに対してガバペンチンよりも6倍高い親和性を持っていることがわかりました。しかし、別の研究では、プレガバリンとガバペンチンがヒト組換えα2δ-1サブユニットに対して同様の親和性を持っていることがわかりました（それぞれKi = 32nMと40nM）。いずれにせよ、プレガバリンは鎮痛剤としてガバペンチンより2〜4倍強力であり、動物では、抗けいれん薬としてガバペンチンより3〜10倍強力であるように見えます。